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NGS Risequenziamento mirato

Il risequenziamento mirato rappresenta una strategia di sequenziamento molto efficace per l’analisi rapida di particolari regioni genomiche di interesse, da singoli prodotti di PCR (ampliconi) a regioni genomiche più ampie selezionate mediante tecniche di cattura per ibridazione.

 

 

 

Applicazioni:

  • Rilevazione, screening e validazioni di varianti geniche
  • Identificazione di carica virale
  • Screening di farmaci
  • Screening di knockout
  • Genotipizzazioni
  • Aplotipizzazioni
  • Analisi di copy number variation
  • Heterozygote detection
  • Metagenomica (identificazione di batteri in campioni complessi, 16S rRNA)
  • Mutagenesi
  • Verifica di inserti in vettori e plasmidi
  • Verifica di trasfezioni/infezioni
  • Analisi epigenetiche (metilazione)

Sequenziamento di prodotti di PCR

Il sequenziamento di ampliconi viene effettuato integrando adapters specifici per la piattaforma di sequenziamento sui prodotti di PCR sia durante la PCR che dopo l’amplificazione mediante ligation. I prodotti di PCR che avranno integrato gli adapters durante la PCR (che costituiranno la library) si possono direttamente utilizzare per essere purificati, ulteriormente amplificati e sequenziati. Con l’opzione multiplexing è possibile sequenziare una vasta gamma di combinazioni di campioni per ciclo ma con la possibilità di identificare accuratamente i campioni durante l’analisi bioinformatica.

Workflow del servizio “Sequenziamento di prodotti di PCR”.

  • Consulenza – Una consulenza gratuita vi sarà fornita per l’ottimizzazione del progetto (numero campioni da analizzare, metodologia, costi)
  • Invio del campione – Il campione da analizzare (DNA genomico da tessuti, cellule o fluidi biologici) dovrà possedere requisiti di integrità e purezza che dovranno essere conformi agli standard adottati nel laboratorio Microgem. Durante la fase di consulenza saranno forniti consigli sulla metodica di estrazione da adottare. In alternativa è possibile usufruire del nostro service di isolamento di DNA. E’ possibile inviare anche prodotti di PCR (corredati di un’immagine dell’analisi su gel) a cui verranno ligati adapters specifici per la piattaforma di sequenziamento.
  • Controllo di qualità del campione (QC) – Dopo aver ricevuto i campioni di DNA o i prodotti di PCR, i nostri ricercatori valuteranno l’integrità e la purezza di ogni campione inviato mediante lettore per microvolumi MaestroNano e Bioanalyzer. Saranno altresì valutati possibili contaminazioni per ogni campione. I risultati di questa analisi saranno inviati al ricercatore prima di proseguire con le successive fasi del servizio.
  • Preparazione della library di ampliconi – La preparazione della library di ampliconi prevede il disegno degli oligo contenenti regioni specifiche per la piattaforma di sequenziamento. Alternativamente ai prodotti di PCR dopo purificazione, verranno ligati adapters specifici per la piattaforma di sequenziamento. La fase successiva prevede un’amplificazione mediante PCR (library), la purificazione mediante biglie e la quantizzazione della library.
  • Amplificazione e sequenziamento della library – In questa fase è prevista l’amplificazione clonale della library e il sequenziamento su piattaforma NGS.
  • Analisi dei dati – L’analisi dei dati verrà effettuata mediante filtraggio delle reads. Allineamento delle reads a sequenze di riferimento. Rilevazione e quantificazione di varianti note e nuove varianti (SNPs, inserzioni, delezioni e varianti strutturali).
  • Relazione finale – A conclusione del progetto verrà consegnata una relazione finale comprensiva dei risultati delle varie fasi di sviluppo del progetto. I risultati presentati nella relazione potranno essere discussi con il team scientifico di Microgem.

Sequenziamento per cattura ad ibridazione

Il sequenziamento di regioni mediante cattura per ibridazione prevede la frammentazione del DNA genomico per la preparazione della library e la successiva ibridazione ad un pool di oligonucleotidi specifici per una determinata regione genomica.

Workflow del servizio “Sequenziamento per cattura ad ibridazione”.

  • Consulenza – Una consulenza gratuita vi sarà fornita per l’ottimizzazione del progetto (numero campioni da analizzare, metodologia, costi)
  • Invio del campione – Il campione da analizzare (DNA genomico da tessuti, cellule o fluidi biologici) dovrà possedere requisiti di integrità e purezza che dovranno essere conformi agli standard adottati nel laboratorio Microgem. Durante la fase di consulenza saranno forniti consigli sulla metodica di estrazione da adottare. In alternativa è possibile usufruire del nostro service di isolamento di DNA.
  • Controllo di qualità del campione (QC) – Dopo aver ricevuto i campioni di DNA, o i prodotti di PCR, i nostri ricercatori valuteranno l’integrità e la purezza di ogni campione inviato mediante lettore per microvolumi MaestroNano e Bioanalyzer. Saranno altresì valutati possibili contaminazioni per ogni campione. I risultati di questa analisi saranno inviati al ricercatore prima di proseguire con le successive fasi del servizio.
  • Preparazione della library – La preparazione della library prevede la frammentazione del DNA genomico. La library verrà poi ibridata ad un pool di oligonucleotidi specifici per una determinata regione genomica. Mediante lavaggi, verranno rimossi i frammenti di DNA non ibridati ed eluiti i frammenti ibridati. La fase successiva La fase successiva prevede un’amplificazione mediante PCR (library), la purificazione mediante biglie e la quantizzazione della library mediante PicoGreen.
  • Amplificazione e sequenziamento della library – In questa fase è prevista l’amplificazione clonale della library e il sequenziamento su piattaforma NGS.
  • Analisi dei dati – L’analisi dei dati verrà effettuata mediante filtraggio delle reads. Allineamento delle reads a sequenze di riferimento. Rilevazione e quantificazione di varianti note e nuove varianti (SNPs, inserzioni, delezioni e varianti strutturali).
  • Relazione finale – A conclusione del progetto verrà consegnata una relazione finale comprensiva dei risultati delle varie fasi di sviluppo del progetto. I risultati presentati nella relazione potranno essere discussi con il team scientifico di Microgem.