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Analisi dei profili di espressione genica

L’analisi dei profili di espressione genica, mediante microarray, permette di valutare in maniera simultanea l’espressione di migliaia di geni in un campione biologico. Il principio su cui si basa è quello dell’ibridazione tra molecole di cRNA marcati e migliaia di oligonucleotidi specifici legati ad un supporto di vetro. La valutazione dei profili di espressione genica, può trovare impiego in diverse applicazioni, quali:

  • Caratterizzazione di marcatori diagnostici
  • Classificazione molecolare di differenti sottotipi di malattia
  • Identificazione di specifici target terapeutici
  • Identificazione di pathways di segnale regolati da geni chiave
  • Drug discovery e studi tossicologici

Microgem Lab fornisce il servizio di “Analisi dei profili di espressione genica” a uno o due colori , estesa copertura del genoma con microarrays ad alta densità, elevata sensibilità anche per bassi livelli di espressione, altissima accuratezza. Possibilità di analizzare trascritti estratti da tessuti e cellule di un’ampia varietà di organismi e specie.

Workflow del servizio di “Analisi dei profili di espressione genica one/two-colors”

  • Consulenza – Una consulenza gratuita vi sarà fornita per l’ottimizzazione del progetto (numero campioni da analizzare, metodologia, costi)
  • Invio del campione – Il campione da analizzare (RNA totale estratto da tessuti o cellule) dovrà possedere requisiti di integrità e purezza che dovranno essere conformi agli standard adottati nel laboratorio Microgem. Durante la fase di consulenza saranno forniti consigli sulla metodica di estrazione da adottare. In alternativa è possibile usufruire del nostro service di isolamento di RNA.
  • Controllo di qualità del campione (QC) – Dopo aver ricevuto i campioni di RNA, i nostri ricercatori valuteranno l’integrità e la purezza di ogni campione inviato mediante lettore per microvolumi MaestroNano e Bioanalyzer. Saranno altresì valutati possibili contaminazioni per ogni campione. I risultati di questa analisi saranno inviati al ricercatore prima di proseguire con le successive fasi del servizio.
  • Marcatura, ibridazione e lettura del microarray – I campioni di RNA (controllo e sperimentale) saranno utilizzati per la produzione di cRNA marcato. Nella procedura one-color tutti i campioni saranno marcati con Cyanine3-CTP e ibridati su microarray specifico. Nella procedura two-colors i campioni controllo e quelli sperimentali saranno marcati rispettivamente con Cyanine3-CTP e Cyanine5-CTP e co-ibridati su microarray specifico. Per il monitoraggio del workflow, durante la procedura di marcatura verranno inseriti controlli Spike-In (miscela di trascritti derivati dal trascrittoma di adenovirus E1A sintetizzati in vitro) in ogni campione e un RNA reference specifico che verrà utilizzato in un esperimento parallelo. Su ogni microarray sono spottati, inoltre, controlli negativi e positivi per il monitoraggio di auto e cross-ibridazione. Dopo i lavaggi il microarray verrà analizzato mediante laser scanner e verrà effettuata la digitalizzazione dell’immagine degli spots fluorescenti.
  • Analisi dei dati – Analisi della qualità dei dati basata sui controlli Spike-In, sull’intensità degli spot e sugli spot flaggati. Una normalizzazione sui dati sarà effettuata sui dati ottenuti sullo stesso microarray e da microarray indipendenti e una Principal Component Analysis (PCA) per identificare variazioni relative al campione biologico o a fattori tecnici. Un diagramma Heat Map permetterà di visualizzare i dati.
  • Analisi statistica dei dati – Successivamente verrà effettuata un’analisi statistica dei dati per la determinazione di geni differenzialmente espressi (T-test, Anova, Volcano Plot per la determinazione dei p-values con o senza correzione, MA e Box plot). Un’analisi di Clustering permetterà di raggruppare geni con alto grado di similarità. In aggiunta verrà effettuata un’analisi dei pathways cellulari di cui fanno parte i geni differenzialmente espressi.
  • Relazione finale – A conclusione del progetto verrà consegnata una relazione finale comprensiva dei risultati delle varie fasi di sviluppo del progetto. I risultati presentati nella relazione potranno essere discussi con il team scientifico di Microgem.