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Analisi interazione proteina/DNA

La ChIP-on-chip è una tecnica utilizzata per lo studio delle interazioni tra DNA e proteine in vivo, combinando l’immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) con la tecnologia dei microarray (chip). Essa permette di analizzare, in un singolo esperimento, un elevato numero di sequenze di DNA (siti di legame) a cui una proteina si lega. I Chip-on-chip sono costituiti da spot di DNA (oligonucleotidi) con sequenze complementari a regioni di promotori di geni o dell’intero genoma. Il principio su cui si basa la tecnica dei ChIP-on- chip è quello dell’ibridazione tra le sonde presenti sul vetrino e le sequenze complementari di DNA genomico immunoprecipitate con la proteina di interesse.
La ChIP-on-chip permette di monitorare il comportamento dei promotori per lo studio dei meccanismi di regolazione dei geni: un ponte tra espressione genica e proteomica reso possibile da arrays che combinano estesa copertura del genoma e grande sensibilità.
Microgem Lab fornisce il servizio di “Analisi di interazione proteina/DNA mediante immunoprecipitazione”. Le analisi sull’intero genoma permetteranno di determinare la localizzazione dei siti di legame. Possibilità di analizzare DNA estratto da tessuti e cellule di un’ampia varietà di organismi e specie.

Workflow del servizio di “Analisi di interazione proteina/DNA mediante immunoprecipitazione”

  • Consulenza – Una consulenza gratuita vi sarà fornita per l’ottimizzazione del progetto (numero campioni da analizzare, metodologia, costi).
  • Invio del campione – Il campione da inviare è costituito da un pellet di cellule trattate con formaldeide, per il cross-link delle proteine al DNA, congelato in N2 liquido e conservato a –80°C. Durante la fase di consulenza saranno forniti consigli sulla metodica di preparazione del campione.
  • Lisi e sonicazione – Il pellet cellulare verrà lisato e centrifugato per l’isolamento dei nuclei. Il DNA estratto dai nuclei verrà sonicato.
  • Immunoprecipitazione del DNA – Il DNA, dopo sonicazione, verrà immunoprecipitato mediante un anticorpo monoclonale specifico per la proteina di interesse legato a biglie magnetiche. Il DNA immunoprecipitato eluito dalle biglie e il DNA reference verranno trattati con enzimi per la digestione di RNA e proteine ed estratti mediante solventi organici.
  • Amplificazione del DNA – I frammenti di DNA, a cui verranno legati linkers di sequenza nota, verranno amplificati mediante PCR.
  • Marcatura, ibridazione e lettura del microarray – Il campione di DNA immunoprecipitato e il DNA reference amplificati saranno marcati, rispettivamente, con Cyanine5-dUTP e Cyanine3-dUTP, purificati e co-ibridati su microarray specifico. Dopo i lavaggi il microarray verrà analizzato mediante scanner e verrà effettuata la digitalizzazione dell’immagine degli spots fluorescenti.
  • Analisi dei dati – Controllo di qualità dei dati (QC) e normalizzazione.
  • Analisi statistica dei dati – Analisi di predizione dei siti di legame. Identificazione e quantificazione delle probes, geni e loci genomici che hanno un legame significativo.
  • Relazione finale – A conclusione del progetto verrà consegnata una relazione finale comprensiva dei risultati delle varie fasi di sviluppo del progetto. I risultati presentati nella relazione potranno essere discussi con il team scientifico.