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NGS Sequenziamento del trascrittoma (microrganismi)

L’analisi del trascrittoma rappresenta un potente strumento a supporto delle analisi di genomi caratterizzate dall’identificazione di varianti genetiche, come polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs) e inserzioni/delezioni (ins/dels). L’abbinamento delle informazioni sulla variazione genetica con i relativi livelli di espressione genera un dato globale utile nella caratterizzazione dello stato di un determinato campione. Mediante sequenziamento dell’RNA (totale o mRNA), oltre al sequenziamento dei trascritti è possibile analizzare i livelli dei profili di espressione genica di un singolo campione, o paragonare i profili di espressione genica tra campioni multipli. Il sequenziamento del trascrittoma fornisce anche informazioni riguardo nuove isoforme di trascritti, incluso l’identificazione di trascritti di splicing alternativo o trascritti di fusione e cSNPs (coding single nucleotide polymorphisms). Inoltre con la tecnica di cattura per ibridazione è possibile sequenziare solo target di interesse. Possibilità di sequenziamento de novo di trascrittomi di genomi non caratterizzati. In aggiunta è possibile analizzare small RNA (da RNA totale o da frazioni arricchite di small RNA) sia per l’analisi di espressione differenziale che per l’identificazione di nuovi small RNA.

Caratteristiche:

  • Quantizzazione dei livelli di espressione dei trascritti
  • Range dinamico per la rivelazione di trascritti con bassi livelli di espressione
  • Capacità di analizzare trascritti con o senza una sequenza di riferimento

Workflow del servizio “Sequenziamento del trascrittoma”.

  1. Consulenza – Una consulenza gratuita vi sarà fornita per l’ottimizzazione del progetto (numero campioni da analizzare, metodologia, costi)
  2. Invio del campione – Il campione da analizzare (RNA) dovrà possedere requisiti di integrità e purezza che dovranno essere conformi agli standard adottati nel laboratorio Microgem. Durante la fase di consulenza saranno forniti consigli sulla metodica di estrazione da adottare. In alternativa è possibile usufruire del nostro service di isolamento di RNA.
  3. Controllo di qualità del campione (QC) – Dopo aver ricevuto i campioni di RNA, i nostri ricercatori valuteranno l’integrità e la purezza di ogni campione inviato mediante lettore per microvolumi MaestroNano e Bioanalyzer. Saranno altresì valutati possibili contaminazioni per ogni campione. I risultati di questa analisi saranno inviati al ricercatore prima di proseguire con le successive fasi del servizio.
  4. Preparazione della library – La preparazione della library prevede la frammentazione dell’RNA, la sintesi di cDNA a doppio filamento, la purificazione dei frammenti ai quali vengono ligati adapters specifici per la piattaforma di sequenziamento. Purificazione e quantizzazione della library.
  5. Amplificazione e sequenziamento della library – In questa fase è prevista l’amplificazione clonale della library e il sequenziamento su piattaforma NGS.
  6. Analisi dei dati – L’analisi dei dati verrà effettuata mediante filtraggio delle reads. Annotazioni di genomi non caratterizzati, identificazione di nuovi trascritti o isoforme di splicing alternativo e/o trascritti di fusione. Mappatura di EST a genomi di riferimento o trascrittomi per analisi comparativa. Rilevazione di varianti genetiche (SNPs, inserzioni, delezioni).
  7. Relazione finale – A conclusione del progetto verrà consegnata una relazione finale comprensiva dei risultati delle varie fasi di sviluppo del progetto. I risultati presentati nella relazione potranno essere discussi con il team scientifico di Microgem.