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Analisi di metilazione del DNA

La regolazione dell’espressione genica è un processo molto complesso e finemente controllato da vari fattori. Tra i meccanismi di regolazione epigenetica, la metilazione del DNA a livello delle CpG island e nel promotore del gene svolge un ruolo importante nell’espressione e nel silenziamento genico. Alterazioni dei meccanismi della regolazione epigenetica sono alla base di numerose patologie tra cui il cancro.
Microgem Lab fornisce il servizio di “Analisi di metilazione del DNA” su microarray mediante immunoprecipitazione (MeDIP-chip). Con gli arrays per metilazione focalizzati sulle regioni CpG Island o del promotore, è possibile investigare gli eventi epigenetici di metilazione che alterano la regolazione dell’espressione genica. Possibilità di analizzare DNA estratto da tessuti e cellule di un’ampia varietà di organismi e specie.

Workflow del servizio di “Analisi di metilazione del DNA mediante immunopreciptazione”

  • Consulenza – Una consulenza gratuita vi sarà fornita per l’ottimizzazione del progetto (numero campioni da analizzare, metodologia, costi)
  • Invio del campione – Il campione da analizzare (DNA totale estratto da tessuti, cellule, di uomo e topo) dovrà possedere requisiti di integrità e purezza che dovranno essere conformi agli standard adottati nel laboratorio Microgem. Durante la fase di consulenza saranno forniti consigli sulla metodica di estrazione da adottare. In alternativa è possibile usufruire del nostro service di isolamento di DNA.
  • Controllo di qualità del campione (QC) – Dopo aver ricevuto i campioni di DNA, i nostri ricercatori valuteranno l’integrità e la purezza di ogni campione inviato mediante lettore per microvolumi MaestroNano e Bioanalyzer. Saranno altresì valutati possibili contaminazioni per ogni campione. I risultati di questa analisi saranno inviati prima di proseguire con le successive fasi del servizio.
  • Immunoprecipitazione del DNA metilato – Il DNA metilato, dopo essere stato sonicato, verrà immunoprecipitato mediante un anticorpo monoclonale anti-metilcitosina legato a biglie magnetiche. Il DNA immunoprecipitato eluito dalle biglie e il DNA reference verranno estratti mediante solventi organici.
  • Marcatura, ibridazione e lettura del microarray – Il campione di DNA immunoprecipitato e il DNA reference saranno marcati, rispettivamente, con Cyanine5-dUTP e Cyanine3-dUTP, purificati e co-ibridati su microarray specifico. Per il monitoraggio della marcatura verranno inseriti controlli Spike-In costituti da prodotti di PCR non metilati, parzialmente metilati ed altamente metilati. Dopo i lavaggi il microarray verrà analizzato mediante scanner e verrà effettuata la digitalizzazione dell’immagine degli spots fluorescenti.
  • Analisi dei dati – Analisi dei rapporti Cyanine5/Cyanine3. Se per ogni campione si effettuano esperimenti con 2 o più array viene eseguita una normalizzazione.
  • Analisi statistica dei dati –Identificazione e quantificazione delle regioni genomiche metilate mediante specifici algoritmi (Z-score e BATMAN).
  • Relazione finale – A conclusione del progetto verrà consegnata una relazione finale comprensiva dei risultati delle varie fasi di sviluppo del progetto. I risultati presentati nella relazione potranno essere discussi con il team scientifico.