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Analisi dei profili di espressione di miRNA

I microRNA (miRNA) sono un’ampia classe di piccoli RNA non codificanti (21-25 nucleotidi) che regolano l’espressione genica a livello post-trascrizionale, inducendo la degradazione di specifici RNA messaggeri (mRNA), o impedendo la traduzione in proteina. L’analisi dei profili di espressione di miRNA, mediante microarray, permette di valutare in maniera simultanea l’espressione di centinaia di miRNA in un campione biologico. Il principio su cui si basa è quello dell’ibridazione tra molecole di miRNA marcati e migliaia di oligonucleotidi specifici legati ad un supporto di vetro.
Numerosi studi hanno dimostrato il coinvolgimento dei miRNA in diverse patologie cardiovascolari, neurologiche, nell’obesità, nel diabete e nel cancro. I miRNA presentano caratteristiche biologiche che li rendono potenzialmente idonei in applicazioni cliniche come marcatori di diagnosi precoce e di monitoraggio di strategie terapeutiche.
Microgem Lab fornisce il servizio di “Analisi dei profili di espressione di miRNA” one-color, estesa copertura del miRNoma con microarrays ad alta densità, elevata sensibilità anche per bassi livelli di espressione, altissima accuratezza. Possibilità di analizzare miRNA estratti da tessuti e cellule di un’ampia varietà di organismi e specie.

Workflow del servizio di “Analisi dei profili di espressione di miRNA” one-color

  • Consulenza – Una consulenza gratuita vi sarà fornita per l’ottimizzazione del progetto (numero campioni da analizzare, metodologia, costi)
  • Invio del campione – Il campione da analizzare (RNA totale estratto da tessuti, cellule, plasma, siero di uomo, topo, ratto) dovrà possedere requisiti di integrità e purezza che dovranno essere conformi agli standard adottati nel laboratorio Microgem. Durante la fase di consulenza saranno forniti consigli sulla metodica di estrazione da adottare. In alternativa è possibile usufruire della nostra esperienza nell’isolamento dell’RNA.
  • Controllo di qualità del campione (QC) – Dopo aver ricevuto i campioni di RNA, i nostri ricercatori valuteranno l’integrità e la purezza di ogni campione inviato mediante lettore per microvolumi MaestroNano e Bioanalyzer. Saranno altresì valutati possibili contaminazioni per ogni campione. I risultati di questa analisi saranno inviati prima di proseguire con le altre fasi del servizio.
  • Marcatura, ibridazione e lettura del microarray – Il campione di RNA sarà defosforilato, marcato con Cyanine3-pCp e ibridato su microarray specifico. Per il monitoraggio del workflow, durante la procedura di marcatura verranno inseriti controlli Spike-In (miRNA di Drosophila) in ogni campione e un RNA reference specifico verrà utilizzato in un esperimento parallelo. Inoltre su ogni microarray sono depositati controlli negativi e positivi per il monitoraggio di auto e cross-ibridazione. Dopo i lavaggi il microarray verrà analizzato mediante scanner e verrà effettuata la digitalizzazione dell’immagine degli spots fluorescenti.
  • Analisi dei dati – Analisi della qualità dei dati basata sui controlli Spike-In, sull’intensità degli spot e sugli spot flaggati. Per il confronto dei dati ottenuti da microarray indipendenti verrà eseguita una normalizzazione. Una Principal Component Analysis (PCA) verrà effettuata per identificare variazioni relative al campione biologico o a fattori tecnici. Un diagramma Heat Map permetterà di visualizzare i dati di un Unsupervised Hierarchical Clustering dei miRNA su tutti i campioni analizzati.
  • Analisi statistica dei dati – Successivamente verrà effettuata un’analisi statistica dei dati per la determinazione di miRNA differenzialmente espressi (T-test o Anova per la determinazione dei p-values con o senza correzione, MA e Box plot). Un’analisi Volcano plot permetterà di visualizzare i miRNA con i p-values più bassi. In aggiunta verrà effettuata un’analisi di predizione dei target molecolari dei miRNA mediante database (TargetScan, TarBase).
  • Relazione finale – A conclusione del progetto verrà consegnata una relazione finale comprensiva dei risultati delle varie fasi di sviluppo del progetto. I risultati presentati nella relazione potranno essere discussi con il team scientifico